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Receptor tyrosine kinases in granulosa cells of ovulating follicles in mice

Successful expulsion of a fertilizable oocyte from follicles, ovulation, requires the actions of extracellular and intracellular signals including those mediated by Receptor tyrosine kinases (RTKs) and growth factors. The activation of the epidermal growth factor Receptor (Egfr) has been well established during ovulation induced by the preovulatory surge of luteinizing hormone (LH). However, potential roles for other RTKs and their respective growth factors have not been thoroughly studied during ovulation. Therefore, the aim of this project was to analyze growth factor signaling induced by LH in mouse granulosa cells of ovulating follicles. Granulosa cell samples were collected from immature mice, superstimulated with equine chorionic gonadotropin (eCG) and human chorionic gonadotropin (hCG) at 48h apart. We used the Mouse Phospho-RTK Array Kit to systematically catalogue the RTKs that are activated by LH signaling. There was an increase in phosphorylation of fibroblast growth factor Receptor 2 (Fgfr2) and Ephrin Receptor B1 (EphB1) in granulosa cells at 4h post-hCG when compared to 0h hCG. We measured the expression of the genes encoding Fgfr isoforms and EphB1 along with their respective ligands. The relative mRNA abundance of the Receptors did not change upon hCG treatment. However, transcript levels of their respective ligands, fibroblast growth factor 2 (Fgf2) and Ephrin-B1 (EfnB1), increased significantly at 4h post-hCG. We also found that protein abundance of Fgf2 increased at hCG4h. Further qPCR analyses revealed that increased Fgf2 expression was associated with decreased mRNA abundance of Spry3, a member of the Sprouty family of proteins known to inhibit FGF signaling. Finally, intraperitoneal treatment with two Fgfr inhibitors (AZD4547 or BGJ398) did not alter ovulation rate when compared to vehicle treatment. Taken together, the present study investigated two RTK pathways in granulosa cells of preovulatory ovulating follicles in mice. The ovulatory stimulus with hCG induces the expression of the ligands Fgf2 and EfnB1 in association with increased phosphorylation of their respective Receptors, Fgfr2 IIIC and EphB1 in granulosa cells. However, FGF and Ephrin pathways do not appear to be obligatory for ovulation. Their temporal association with luteinization suggests that they may participate in the formation of the CL, which require further investigation.Expulsion d'un ovocyte fécondable à partir des follicules nécessite l'action des signaux extracellulaires et intracellulaires, y compris ceux médiés par les récepteurs de tyrosine kinase (RTK). L'activation du récepteur épidermique de facteur de croissance (Egfr) a été bien établi suivant le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH). Cependant, les rôles potentiels pour les autres RTK et de leurs facteurs de croissance respectifs n'ont pas été profondement étudiées au moment du pic LH. Par conséquent, l'objectif de ce projet était d'analyser la signalisation des facteurs de croissance induite par LH dans les cellules de la granulosa de souris. Des échantillons de cellules de la granulosa ont été recueillies à partir des souris, superstimulé avec la gonadotrophine chorionique équine (eCG) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) à 48 h d'intervalle. Nous avons utilisé le Mouse Phospho-RTK Array Kit afin de determiner les RTK qui sont activés par une signalisation de LH. Il y avait une augmentation de la phosphorylation du récepteur de fibroblastes de facteur de croissance 2 (Fgfr2) et le récepteur éphrine B1 (EphB1) dans les cellules de la granulosa à 4h hCG par rapport à 0h hCG. Nous avons mesuré l'expression des gènes codant pour des isoformes Fgfr et EphB1 avec leurs ligands respectifs. L'abondance de l'ARNm relative des récepteurs n'a pas changé sur le traitement de l'hCG. Cependant, les niveaux de leurs facteurs de croissance respectifs, Fgf2 et EfnB1, ont augmenté de manière significative à hCG4h. Nous avons également constaté que l’abondance de protéine de Fgf2 a augmenté à hCG4h. De plus, l'augmentation de l'expression du Fgf2 a été associée à une diminution de la quantité d'ARNm Spry3, un membre de la famille Sprouty de protéines connues pour inhiber la signalisation de Fgf. Enfin, le traitement par voie intrapéritonéale avec deux inhibiteurs de Fgfr (AZD4547 ou BGJ398) n'a pas modifié le taux d'ovulation. Dans l'ensemble, la présente étude a identifié deux nouvelles voies RTK dans les cellules de la granulosa des follicules pré-ovulatoires chez la souris. Le stimulus ovulatoire de hCG induit l'expression du Fgf2 et EfnB1 en liaison avec une phosphorylation accrue de leurs récepteurs respectifs, Fgfr2 IIIC et EphB1 dans les cellules de la granulosa. Cependant, les voies de signalization de Fgfs et éphrines ne semblent pas être obligatoire pour l'ovulation. Leur association temporelle avec la lutéinisation suggère qu'ils peuvent participer à la formation de la CL