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David Arnaud - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Protéomique fonctionnelle des Métalloprotéases Matricielles (MMPs) dédiée à la détection des formes acitves de MMPs dans des protéomes complexes.
HAL CCSD, 2007Co-Authors: David ArnaudAbstract:The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix. Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new Photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by Photoaffinity labelling. Furthermore, as the new developed probe incorporated a radioactive element, Photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the Photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the Photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new Photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins. Key-words: matrix metalloproteinases; functional proteomics; Photoaffinity probe; zymographyLes Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture
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Protéomique fonctionnelle dédiée aux Métalloprotéases Matricielles (MMPs) (développement d'une méthode extrêmement sensible permettant la détection des formes actives des MMPs dans les protéomes complexes)
2007Co-Authors: David Arnaud, Dive VincentAbstract:Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d identifier le rôle particulier et le taux d expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde deradiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance,implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix.Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new Photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by Photoaffinity labelling. Furthermore, asthe new developed probe incorporated a radioactive element, Photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the Photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the Photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new Photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins.PARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF
Anna Radominskapandya - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Photoaffinity labeling of human retinoid x receptor beta rxrbeta with 9 cis retinoic acid identification of phytanic acid docosahexaenoic acid and lithocholic acid as ligands for rxrbeta
Biochemistry, 2002Co-Authors: Anna Radominskapandya, Guangping ChenAbstract:We utilized [20-methyl-(3)H]-9-cis-retinoic acid ([(3)H]9-cis-RA) as a direct Photoaffinity probe for the characterization of human recombinant retinoid X receptor beta protein (RXRbeta). The Photoaffinity labeling was light- and concentration-dependent, saturable, and protected by unlabeled 9-cis-RA in a concentration-dependent manner, indicating that binding occurred in the RXR retinoid binding site. all-trans-Retinoic acid (atRA) did not affect labeling with the 9-cis derivative, confirming that atRA does not compete for the 9-cis-RA binding site. Several retinoid, fatty acid, and bile acid ligands were evaluated for their ability to recognize the 9-cis-RA binding site. Retinol, atRA glucuronide, 13-cis-RA, dolichol, 5,6-epoxy-RA, and vitamin D(3) did not compete for the 9-cis-RA binding site. However, the saturated diterpenoid phytanic acid (PA) and docosahexaenoic acid, which have been recently shown to activate the nuclear receptor, RXR, competed with 9-cis-RA labeling, showing high affinity for the 9-cis-RA binding site. Oleic acid, arachidonic acid, and butyric acid did not interact. However, the bile acid lithocholic acid competed efficiently with 9-cis-RA for the binding site. These data validated the Photoaffinity assay as an excellent system for the identification and evaluation of ligands for RXR.
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Photoaffinity labeling probe for the substrate binding site of human phenol sulfotransferase sult1a1 7 azido 4 methylcoumarin
Protein Science, 1999Co-Authors: Guangping Chen, Eric Battaglia, Claire Senay, Charles N Falany, Anna RadominskapandyaAbstract:A novel fluorescent photoactive probe 7-azido-4-methylcoumarin (AzMC) has been characterized for use in Photoaffinity labeling of the substrate binding site of human phenol sulfotransferase (SULT1A1 or P-PST-1). For the Photoaffinity labeling experiments, SULT1A1 cDNA was expressed in Escherichia coli as a fusion protein to maltose binding protein (MBP) and purified to apparent homogeneity over an amylose column. The maltose moiety was removed by Factor Xa cleavage. Both MBSULT1A1 and SULT1A1 were efficiently photolabeled with AzMC. This labeling was concentration dependent. In the absence of light, AzMC competitively inhibited the sulfation of 4MU catalyzed by SULT1A1 (Ki = 0.47 +/- 0.05 mM). Moreover, enzyme activity toward 2-naphthol was inactivated in a time- and concentration-dependent manner. SULT1A1 inactivation by AzMC was protected by substrate but was not protected by cosubstrate. These results indicate that Photoaffinity labeling with AzMC is highly suitable for the identification of the substrate binding site of SULT1A1. Further studies are aimed at identifying which amino acids modified by AzMC are localized in the binding site.
Guangping Chen - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Photoaffinity labeling of human retinoid x receptor beta rxrbeta with 9 cis retinoic acid identification of phytanic acid docosahexaenoic acid and lithocholic acid as ligands for rxrbeta
Biochemistry, 2002Co-Authors: Anna Radominskapandya, Guangping ChenAbstract:We utilized [20-methyl-(3)H]-9-cis-retinoic acid ([(3)H]9-cis-RA) as a direct Photoaffinity probe for the characterization of human recombinant retinoid X receptor beta protein (RXRbeta). The Photoaffinity labeling was light- and concentration-dependent, saturable, and protected by unlabeled 9-cis-RA in a concentration-dependent manner, indicating that binding occurred in the RXR retinoid binding site. all-trans-Retinoic acid (atRA) did not affect labeling with the 9-cis derivative, confirming that atRA does not compete for the 9-cis-RA binding site. Several retinoid, fatty acid, and bile acid ligands were evaluated for their ability to recognize the 9-cis-RA binding site. Retinol, atRA glucuronide, 13-cis-RA, dolichol, 5,6-epoxy-RA, and vitamin D(3) did not compete for the 9-cis-RA binding site. However, the saturated diterpenoid phytanic acid (PA) and docosahexaenoic acid, which have been recently shown to activate the nuclear receptor, RXR, competed with 9-cis-RA labeling, showing high affinity for the 9-cis-RA binding site. Oleic acid, arachidonic acid, and butyric acid did not interact. However, the bile acid lithocholic acid competed efficiently with 9-cis-RA for the binding site. These data validated the Photoaffinity assay as an excellent system for the identification and evaluation of ligands for RXR.
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Photoaffinity labeling probe for the substrate binding site of human phenol sulfotransferase sult1a1 7 azido 4 methylcoumarin
Protein Science, 1999Co-Authors: Guangping Chen, Eric Battaglia, Claire Senay, Charles N Falany, Anna RadominskapandyaAbstract:A novel fluorescent photoactive probe 7-azido-4-methylcoumarin (AzMC) has been characterized for use in Photoaffinity labeling of the substrate binding site of human phenol sulfotransferase (SULT1A1 or P-PST-1). For the Photoaffinity labeling experiments, SULT1A1 cDNA was expressed in Escherichia coli as a fusion protein to maltose binding protein (MBP) and purified to apparent homogeneity over an amylose column. The maltose moiety was removed by Factor Xa cleavage. Both MBSULT1A1 and SULT1A1 were efficiently photolabeled with AzMC. This labeling was concentration dependent. In the absence of light, AzMC competitively inhibited the sulfation of 4MU catalyzed by SULT1A1 (Ki = 0.47 +/- 0.05 mM). Moreover, enzyme activity toward 2-naphthol was inactivated in a time- and concentration-dependent manner. SULT1A1 inactivation by AzMC was protected by substrate but was not protected by cosubstrate. These results indicate that Photoaffinity labeling with AzMC is highly suitable for the identification of the substrate binding site of SULT1A1. Further studies are aimed at identifying which amino acids modified by AzMC are localized in the binding site.
David A. Arnaud - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Protéomique fonctionnelle des métalloprotéases naturelles (MMPs) dédiée à la détection des formes actives de MMPs dans des protéomes complexes.
HAL CCSD, 2007Co-Authors: David A. ArnaudAbstract:The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix. Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new Photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by Photoaffinity labelling. Furthermore, as the new developed probe incorporated a radioactive element, Photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the Photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the Photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new Photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins. Key-words: matrix metalloproteinases; functional proteomics; Photoaffinity probe; zymography.Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l'ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd'hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d'inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd'hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d'identifier le rôle particulier et le taux d'expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d'une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d'un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde de radiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d'identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d'expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance, implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture
Dive Vincent - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Protéomique fonctionnelle dédiée aux Métalloprotéases Matricielles (MMPs) (développement d'une méthode extrêmement sensible permettant la détection des formes actives des MMPs dans les protéomes complexes)
2007Co-Authors: David Arnaud, Dive VincentAbstract:Les Métalloprotéases matricielles (MMPs) constituent une famille des métalloprotéases à zinc capables conjointement de dégrader l ensemble des protéines de la matrice extracellulaire. Aujourd hui, vingt-trois MMPs humaines ont été identifiées et sont caractérisées par leur séquence en aminoacides et leur structure 3D fortement conservées. Ces enzymes sont exprimées de manière constitutive au cours des processus de remodelage tissulaire. Leur surexpression dans un certain nombre de pathologies étroitement liée au phénomène d inflammation (arthrite, emphysème, cancer) fait des MMPs des cibles thérapeutiques de choix. Cependant, le remodelage entraînant des modifications des contacts cellulaires, les MMPs apparaissent aujourd hui comme des protéines des voies de signalisation à part entière. Les récentes découvertes de substrats des MMPs ne faisant pas partie des constituants de la matrice extracellulaire renforcent cette vision. Dans le but d identifier le rôle particulier et le taux d expression protéique des MMPs dans un contexte pathologique, nous avons développé une technique de protéomique fonctionnelle dédiée à la détection des formes actives des MMPs dans des échantillons tumoraux. Cette technique repose sur le développement d une nouvelle sonde de photoaffinité, basée sur la structure d un puissant inhibiteur des MMPs de type phosphinique, permettant de cibler les MMPs sous forme active et de les isoler par marquage par photoaffinité. Le marquage par photoaffinité nous permet ainsi grâce à un élément radioactif incorporé à la sonde deradiomarquer les protéines ciblées. Cette sonde a montré in vitro sa capacité remarquable à modifier de manière covalente la hMMP-12 avec un rendement de 42 %, affichant une sensibilité extrême de détection (2.5 fmoles de hMMP-12). En présence de protéome complexe, la sensibilité de détection de la sonde pour la hMMP-12 est tout à fait comparable (5 fmoles) ; la hMMP-12 représente une fraction de 0.001 % de la quantité totale des protéines. Cette méthode nous a permis également d identifier de manière indirecte les formes actives des gélatinases en comparant les extraits tumoraux traités par la sonde et les extraits tumoraux analysés en zymographie. Ces études indiquent que les niveaux d expression des formes actives de MMPs sont très faibles (fmoles) ne permettant pas une caractérisation de celles-ci par spectrométrie de masse, ce qui constitue un véritable défi pouvant être abordé avec de nouvelles sondes incorporant une biotine. Cet exemple de protéines exprimées sous forme active en très faible abondance,implique une orientation des efforts à consentir vers le développement de nouvelles stratégies de capture.The Matrix Metalloproteinases (MMP) represent a family of Zinc dependent extracellular proteinases able to cleave collectively all the proteins constituting the extracellular matrix.Currently, 23 human MMP have been identified and are characterized by their sequence in aminoacids and their highly conserved 3D structure. These enzymes are expressed constitutively during the tissue remodelling process. Their over-expression in various diseases tightly related to inflammatory processes (arthritis, emphysema, cancer) described MMP as choice therapeutic targets. However, as the tissue remodelling implicates modification of cellular contacts, MMP appear currently as proteins involved in signalling pathways. Recent works demonstrating that MMP are able to cleave substrates, which are different than proteins constituting the extracellular matrix, reinforce this vision. In order to identify the individual role and the protein expression level of MMP in pathological context, we developed a new technique of functional proteomics dedicated to the detection of active forms of MMP in tumour samples. This technique relied on the development of a new Photoaffinity probe, based on the structure of a potent phosphinic inhibitor of MMP, allowing targeting and isolating active forms of MMP by Photoaffinity labelling. Furthermore, asthe new developed probe incorporated a radioactive element, Photoaffinity labelling permitted to radiolabel the targeted proteins. This probe demonstrated in vitro its remarkable ability to covalently modify the hMMP-12, with a singular cross-linking yield, determined at 42 %, displaying an extremely sensitive detection (2.5 fmoles of hMMP-12). When added to complex proteome, the Photoaffinity probe presents the same sensibility of detection for the hMMP-12 (5 fmoles); importantly, in this case, hMMP-12 represents only 0.001 % of the totality of the proteins present in the sample. Moreover, this technique allows us to identify active forms of gelatinases (MMP-2 & -9) in an indirect manner by comparing the results of tumour samples treated with the Photoaffinity probe and the results of tumour samples analysed in zymography. These studies indicate that the protein expression levels of active forms of MMP are extremely low (fmoles) and do not permit any characterisation of those forms of MMP by mass spectrometry, constituting a genuine challenge which can be approached by the development of new Photoaffinity probes incorporating a biotin-group. The example of this class of proteins expressed in very low abundance under active form implicates to grant efforts to develop new strategies allowing the capture of the targeted proteins.PARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF
