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Kuniyuki Hugo - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Citopatologia de tecido caloso infetado pelo vírus do enrolamento da folha da videira 3
Sociedade Brasileira de Fitopatologia, 2015Co-Authors: Scagliusi, Sandra M. M., Vega Jorge, Kuniyuki HugoAbstract:The cytopathology of grapevine (Vitis spp.) callus tissue infected with Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), genus Vitivirus was studied in order to investigate the usefulness of callus cultures to study grapevine leafroll-associated viruses. Ultrathin sections were made from in vitro callus obtained from stems and shoots of GLRaV-3 infected grapevine plants. Callus was composed of two types of tissue. Translucent, soft callus was formed and composed of large loosely arranged cells, containing big vacuoles and a thin layer of cytoplasm. Other parts of the callus were brown-coloured and composed of small compactly arranged cells, which showed flexuous and rod-shaped closterovirus-like particles, with 10-12 nm in diameter, at higher magnifications. Groups of vesicles formed by a single membrane were also observed, with sizes ranging from 50-200 nm, containing fine fibrillar material, also typical of closterovirus infections. Virus concentration was monitored by Immunosorbent electron microscopy (ISEM) tests, which showed that in vitro culture of callus tissue from grapevine infected plants, could be used to study the GLRaV viruses through many successive generations, despite the decline in virus concentration after repeated transfers. No virus particles were observed in callus tissue obtained from healthy grapevines.Análises citopatológicas do vírus do enrolamento da folha da videira 3 (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3), gênero Vitivirus foram feitas utilizando-se tecido caloso obtido in vitro, para investigar seu uso no estudo do vírus associado ao enrolamento da folha da videira (EFV). Secções ultrafinas foram feitas a partir de cultura de calos obtidos de hastes e brotos de videiras (Vitis spp.) infetadas pelo GLRaV-3. Dois tipos de calos foram observados. Um tipo transparente composto de células grandes e altamente vacuoladas contendo uma fina camada de citoplasma. Um outro tipo, de coloração marrom, composto de um grupo de células pequenas, compactamente arranjadas, cujo citoplasma era bem mais abundante. Nestas células foram observadas, em maior aumento, massas formadas por fibras flexuosas com 10-12 nm de diâmetro, cujo aspecto corresponde ao das partículas de closterovírus em cortes de tecido. Grupos de vesículas também foram observados, com tamanhos variando entre 50-200 nm, formadas por uma única membrana e contendo material fibrilar muito fino, característico de infecções causadas por closterovírus. A concentração do vírus foi monitorada por testes de Immunosorbent electron microscopy (ISEM), os quais mostraram que a cultura de calos obtidos de videiras infetadas pôde ser usada para estudar os vírus associados ao EFV durante várias gerações, apesar da diminuição da concentração de vírus após repetidas transferências. Não foram observadas partículas de vírus em tecido caloso obtidos de videiras sadias
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Citopatologia de tecido caloso infetado pelo vírus do enrolamento da folha da videira 3
'FapUNIFESP (SciELO)', 2015Co-Authors: Scagliusi, Sandra M. M., Vega Jorge, Kuniyuki HugoAbstract:The cytopathology of grapevine (Vitis spp.) callus tissue infected with Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), genus Vitivirus was studied in order to investigate the usefulness of callus cultures to study grapevine leafroll-associated viruses. Ultrathin sections were made from in vitro callus obtained from stems and shoots of GLRaV-3 infected grapevine plants. Callus was composed of two types of tissue. Translucent, soft callus was formed and composed of large loosely arranged cells, containing big vacuoles and a thin layer of cytoplasm. Other parts of the callus were brown-coloured and composed of small compactly arranged cells, which showed flexuous and rod-shaped closterovirus-like particles, with 10-12 nm in diameter, at higher magnifications. Groups of vesicles formed by a single membrane were also observed, with sizes ranging from 50-200 nm, containing fine fibrillar material, also typical of closterovirus infections. Virus concentration was monitored by Immunosorbent electron microscopy (ISEM) tests, which showed that in vitro culture of callus tissue from grapevine infected plants, could be used to study the GLRaV viruses through many successive generations, despite the decline in virus concentration after repeated transfers. No virus particles were observed in callus tissue obtained from healthy grapevines.Análises citopatológicas do vírus do enrolamento da folha da videira 3 (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3), gênero Vitivirus foram feitas utilizando-se tecido caloso obtido in vitro, para investigar seu uso no estudo do vírus associado ao enrolamento da folha da videira (EFV). Secções ultrafinas foram feitas a partir de cultura de calos obtidos de hastes e brotos de videiras (Vitis spp.) infetadas pelo GLRaV-3. Dois tipos de calos foram observados. Um tipo transparente composto de células grandes e altamente vacuoladas contendo uma fina camada de citoplasma. Um outro tipo, de coloração marrom, composto de um grupo de células pequenas, compactamente arranjadas, cujo citoplasma era bem mais abundante. Nestas células foram observadas, em maior aumento, massas formadas por fibras flexuosas com 10-12 nm de diâmetro, cujo aspecto corresponde ao das partículas de closterovírus em cortes de tecido. Grupos de vesículas também foram observados, com tamanhos variando entre 50-200 nm, formadas por uma única membrana e contendo material fibrilar muito fino, característico de infecções causadas por closterovírus. A concentração do vírus foi monitorada por testes de Immunosorbent electron microscopy (ISEM), os quais mostraram que a cultura de calos obtidos de videiras infetadas pôde ser usada para estudar os vírus associados ao EFV durante várias gerações, apesar da diminuição da concentração de vírus após repetidas transferências. Não foram observadas partículas de vírus em tecido caloso obtidos de videiras sadias.384388Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq
Scagliusi, Sandra M. M. - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Citopatologia de tecido caloso infetado pelo vírus do enrolamento da folha da videira 3
Sociedade Brasileira de Fitopatologia, 2015Co-Authors: Scagliusi, Sandra M. M., Vega Jorge, Kuniyuki HugoAbstract:The cytopathology of grapevine (Vitis spp.) callus tissue infected with Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), genus Vitivirus was studied in order to investigate the usefulness of callus cultures to study grapevine leafroll-associated viruses. Ultrathin sections were made from in vitro callus obtained from stems and shoots of GLRaV-3 infected grapevine plants. Callus was composed of two types of tissue. Translucent, soft callus was formed and composed of large loosely arranged cells, containing big vacuoles and a thin layer of cytoplasm. Other parts of the callus were brown-coloured and composed of small compactly arranged cells, which showed flexuous and rod-shaped closterovirus-like particles, with 10-12 nm in diameter, at higher magnifications. Groups of vesicles formed by a single membrane were also observed, with sizes ranging from 50-200 nm, containing fine fibrillar material, also typical of closterovirus infections. Virus concentration was monitored by Immunosorbent electron microscopy (ISEM) tests, which showed that in vitro culture of callus tissue from grapevine infected plants, could be used to study the GLRaV viruses through many successive generations, despite the decline in virus concentration after repeated transfers. No virus particles were observed in callus tissue obtained from healthy grapevines.Análises citopatológicas do vírus do enrolamento da folha da videira 3 (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3), gênero Vitivirus foram feitas utilizando-se tecido caloso obtido in vitro, para investigar seu uso no estudo do vírus associado ao enrolamento da folha da videira (EFV). Secções ultrafinas foram feitas a partir de cultura de calos obtidos de hastes e brotos de videiras (Vitis spp.) infetadas pelo GLRaV-3. Dois tipos de calos foram observados. Um tipo transparente composto de células grandes e altamente vacuoladas contendo uma fina camada de citoplasma. Um outro tipo, de coloração marrom, composto de um grupo de células pequenas, compactamente arranjadas, cujo citoplasma era bem mais abundante. Nestas células foram observadas, em maior aumento, massas formadas por fibras flexuosas com 10-12 nm de diâmetro, cujo aspecto corresponde ao das partículas de closterovírus em cortes de tecido. Grupos de vesículas também foram observados, com tamanhos variando entre 50-200 nm, formadas por uma única membrana e contendo material fibrilar muito fino, característico de infecções causadas por closterovírus. A concentração do vírus foi monitorada por testes de Immunosorbent electron microscopy (ISEM), os quais mostraram que a cultura de calos obtidos de videiras infetadas pôde ser usada para estudar os vírus associados ao EFV durante várias gerações, apesar da diminuição da concentração de vírus após repetidas transferências. Não foram observadas partículas de vírus em tecido caloso obtidos de videiras sadias
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Citopatologia de tecido caloso infetado pelo vírus do enrolamento da folha da videira 3
'FapUNIFESP (SciELO)', 2015Co-Authors: Scagliusi, Sandra M. M., Vega Jorge, Kuniyuki HugoAbstract:The cytopathology of grapevine (Vitis spp.) callus tissue infected with Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), genus Vitivirus was studied in order to investigate the usefulness of callus cultures to study grapevine leafroll-associated viruses. Ultrathin sections were made from in vitro callus obtained from stems and shoots of GLRaV-3 infected grapevine plants. Callus was composed of two types of tissue. Translucent, soft callus was formed and composed of large loosely arranged cells, containing big vacuoles and a thin layer of cytoplasm. Other parts of the callus were brown-coloured and composed of small compactly arranged cells, which showed flexuous and rod-shaped closterovirus-like particles, with 10-12 nm in diameter, at higher magnifications. Groups of vesicles formed by a single membrane were also observed, with sizes ranging from 50-200 nm, containing fine fibrillar material, also typical of closterovirus infections. Virus concentration was monitored by Immunosorbent electron microscopy (ISEM) tests, which showed that in vitro culture of callus tissue from grapevine infected plants, could be used to study the GLRaV viruses through many successive generations, despite the decline in virus concentration after repeated transfers. No virus particles were observed in callus tissue obtained from healthy grapevines.Análises citopatológicas do vírus do enrolamento da folha da videira 3 (Grapevine leafroll-associated virus 3, GLRaV-3), gênero Vitivirus foram feitas utilizando-se tecido caloso obtido in vitro, para investigar seu uso no estudo do vírus associado ao enrolamento da folha da videira (EFV). Secções ultrafinas foram feitas a partir de cultura de calos obtidos de hastes e brotos de videiras (Vitis spp.) infetadas pelo GLRaV-3. Dois tipos de calos foram observados. Um tipo transparente composto de células grandes e altamente vacuoladas contendo uma fina camada de citoplasma. Um outro tipo, de coloração marrom, composto de um grupo de células pequenas, compactamente arranjadas, cujo citoplasma era bem mais abundante. Nestas células foram observadas, em maior aumento, massas formadas por fibras flexuosas com 10-12 nm de diâmetro, cujo aspecto corresponde ao das partículas de closterovírus em cortes de tecido. Grupos de vesículas também foram observados, com tamanhos variando entre 50-200 nm, formadas por uma única membrana e contendo material fibrilar muito fino, característico de infecções causadas por closterovírus. A concentração do vírus foi monitorada por testes de Immunosorbent electron microscopy (ISEM), os quais mostraram que a cultura de calos obtidos de videiras infetadas pôde ser usada para estudar os vírus associados ao EFV durante várias gerações, apesar da diminuição da concentração de vírus após repetidas transferências. Não foram observadas partículas de vírus em tecido caloso obtidos de videiras sadias.384388Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq
Radaelli Paula - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Variabilidade genética e desenvolvimento de ferramentas sorológicas e moleculares para identificação de vírus em videira
Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2009Co-Authors: Radaelli PaulaAbstract:A videira (Vitis spp.), por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como os vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta. Entre as doenças que afetam a videira, as viroses são as mais difíceis de controlar, pois a disseminação e o acúmulo de vírus são favorecidos pelo transporte e emprego de material propagativo infectado. Devido a avançados estudos por meio da biologia molecular, evidências sugerem que alguns vírus em videira, como Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) e Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequentemente apresentam muitas seqüências variáveis, bem como infecções mistas com outros vírus, dificultando a definição das propriedades biológicas das diferentes variantes deste vírus. Um dos objetivos do presente trabalho foiavaliar a variabilidade genética destes três importantes vírus da videira através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de isolados de RSPaV, GLRaV-2 e de GFLV por RT-PCR, utilizando-se primers específicos para cada espécie viral, permitindo a separação em grupos dos isolados estudados por análise filogenética das seqüências obtidas. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas. Os métodos de diagnóstico das viroses da videira podem ser divididos em três categorias. As duas tradicionais incluem os testes biológicos e o diagnóstico sorológico. Mais recentemente, desenvolveram-se os métodos de diagnóstico molecular, com os testes RT-PCR, IC-RT-PCR e RT-PCR em tempo real. Este último é o mais avançado para diagnose e quantificação deácidos nucléicos, pois realiza amplificações de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, além de permitir a detecção de mais de um vírus em uma só reação. Devido às dificuldades em detectar vírus em videira, além do custo elevado dos métodos de diagnose, propôs-se a produção de antissorosespecíficos contra isolados de GLRaV-2 e Grapevine virus B (GVB), desenvolvidos a partir da proteína capsidial expressa em Escherichia coli, e testar seu possível uso para a detecção destes dois vírus, em videiras infectadas. Os genes das CPs foram amplificados via RT-PCR, clonados, seqüenciados e posteriormente subclonados, onde os plasmídeos recombinantes foram empregados na transformação de E. coli e na expressão das proteínas capsidiais. Estas foram purificadas, suas identidades confirmadas em SDS-PAGE e “Western blot”, utilizadas para imunizar coelho. Os antissoros produzidos contra estas proteínas foram capazes de reconhecer as proteínas recombinantes correspondentes em “Western blot” e detectar GLRaV-2 e GVB em tecidos infectados de videiras pelo ELISA indireto, bem como discriminar videiras sadias e infectadas. Muitos vírus que infectam a videira ocorrem em concentrações abaixo do limite de detecção dos testes diagnósticos comumente utilizados. Com isso, um outro objetivo deste trabalho foi detectar importantes vírus dos gêneros Closterovirus (GLRaV-2) eAmpelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1- GLRaV-1 e Grapevine leafroll-associated virus 3 - GLRaV-3), família Closteroviridae, bem como os vírus dos gêneros Foveavirus (RSPaV) e Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) e GVB), família Flexiviridae, através de RT-PCR em tempo real (TaqMan®). Para ampelovírus, com primers degenerados e sondas específicas, foram detectados GLRaV-1 e GLRaV-3 nos isolados e /ou cultivares testados. Para closterovírus, com primers degenerados e sonda específica, detectou-se GLRaV-2 em todas as cultivares testadas e em Nicotiana benthamiana. Os membros da família Flexiviridae GVA, GVB e RSPaV foram detectados através de multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrando-se assim, que a RT-PCR TaqMan® é um método de diagnóstico molecular rápido, quantitativo, confiável, sensível e capaz de detectar mais de um vírus na mesma reação.The vegetative propagation of the grapevine (Vitis spp.) facilitates the dissemination of pathogens, such as viruses, favoring the appearance of complex diseases, by accumulation of different virus species in the same plant. Among the diseases that affect the grapevine, those caused by viruses are the most difficult to control because the dissemination and the accumulation of viruses are favored by the transport and use of infected propagative material. Due to advanced studies with molecular biology, evidences suggest that some grapevine viruses, as Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) and Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequently present polymorphic sequences, as well as mixing infections with other viruses, making difficult to define the biological properties of the different virus variants. Therefore, one objective of this work was to evaluate the variability of these three important viruses of grapevine using the molecular characterization of the coat protein (CP) gene. Fragments comprising the complete CP genes of RSPaV, GLRaV-2 and of GFLV isolates were amplifiedby RT-PCR, using primers for specific regions of each viral species, allowing the separation of the isolate groups by phylogenetic analyses of the sequences. The isolates of each viral species here studied were additionally detected by non-radioactive probes with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independently of the isolate used as template for probe synthesis. The methods of diagnosis of the grapevine virus diseases can be divided in three categories. The two traditional ones include the biological tests and the serologic diagnosis. Recently, the molecular methods of diagnosis have been developed, comprising the tests RT-PCR, IC-RT-PCR and real time RT-PCR. This last one is the most advanced technique of diagnose and quantification of nucleic acids, accomplishing amplifications in precisely way and with higher reproducibility, allowing the detention of more than one virus in a single reaction. Considering the difficulties to detect virus in grapevine, and the high cost of the diagnosis methods it was considered the production ofantisera against isolates of GLRaV-2 and Grapevine virus B (GVB), developed from CPs expressed in Escherichia coli and to test the possibility of using themfor detecting these two viruses in infected grapevines. The CP genes were amplified by RT-PCR, cloned, sequenced and later subcloned, where the recombinant plasmids were employed in the transformation of E. coli and in the expression of CPs. The proteins were purified, their identities confirmed by SDS-PAGE and Western blot and used for immunizing rabbit. The antisera produced against these proteins were capable to recognize corresponding recombinant proteins in Western blot and to detect GLRaV-2 and GVB in infected grapevines by indirect ELISA, as well as discriminating healthy and infected grapevines. Many viruses that infect grapevine occur in concentrations under the limit of detention of the diagnostic tests commonly used. Considering this fact, another objective of the present work was to detect important viruses of the genera Closterovirus (GLRaV-2) and Ampelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1 and Grapevine leafroll-associated virus 3- GLRaV-3), family Closteroviridae, as well as the viruses of the genera Foveavirus (RSPaV) and Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) and the GVB),family Flexiviridae, by real time RT-PCR (TaqMan®). For ampelovirus, with degenerate primers and specific probes GLRaV-1 and GLRaV-3 were detected in isolates and/or cultivars tested. For closterovirus with degenerate primers and specific probes GLRaV-2 was detected in all cultivars tested and in Nicotiana benthamiana. The members of the family Flexiviridae GVA, GVB and RSPaV were detected by multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrating that RT-PCR TaqMan® is a fast method for molecular diagnosis, quantitative, reliable, sensitive and applicable for detecting more than one virus in the same reaction.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESConselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNP
Paula Radaelli - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Variabilidade genética e desenvolvimento de ferramentas sorológicas e moleculares para identificação de vírus em videira
Universidade Federal Rural de Pernambuco, 2009Co-Authors: Paula RadaelliAbstract:A videira (Vitis spp.), por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como os vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta. Entre as doenças que afetam a videira, as viroses são as mais difíceis de controlar, pois a disseminação e o acúmulo de vírus são favorecidos pelo transporte e emprego de material propagativo infectado. Devido a avançados estudos por meio da biologia molecular, evidências sugerem que alguns vírus em videira, como Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) e Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequentemente apresentam muitas seqüências variáveis, bem como infecções mistas com outros vírus, dificultando a definição das propriedades biológicas das diferentes variantes deste vírus. Um dos objetivos do presente trabalho foiavaliar a variabilidade genética destes três importantes vírus da videira através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de isolados de RSPaV, GLRaV-2 e de GFLV por RT-PCR, utilizando-se primers específicos para cada espécie viral, permitindo a separação em grupos dos isolados estudados por análise filogenética das seqüências obtidas. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas. Os métodos de diagnóstico das viroses da videira podem ser divididos em três categorias. As duas tradicionais incluem os testes biológicos e o diagnóstico sorológico. Mais recentemente, desenvolveram-se os métodos de diagnóstico molecular, com os testes RT-PCR, IC-RT-PCR e RT-PCR em tempo real. Este último é o mais avançado para diagnose e quantificação deácidos nucléicos, pois realiza amplificações de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, além de permitir a detecção de mais de um vírus em uma só reação. Devido às dificuldades em detectar vírus em videira, além do custo elevado dos métodos de diagnose, propôs-se a produção de antissorosespecíficos contra isolados de GLRaV-2 e Grapevine virus B (GVB), desenvolvidos a partir da proteína capsidial expressa em Escherichia coli, e testar seu possível uso para a detecção destes dois vírus, em videiras infectadas. Os genes das CPs foram amplificados via RT-PCR, clonados, seqüenciados e posteriormente subclonados, onde os plasmídeos recombinantes foram empregados na transformação de E. coli e na expressão das proteínas capsidiais. Estas foram purificadas, suas identidades confirmadas em SDS-PAGE e Western blot, utilizadas para imunizar coelho. Os antissoros produzidos contra estas proteínas foram capazes de reconhecer as proteínas recombinantes correspondentes em Western blot e detectar GLRaV-2 e GVB em tecidos infectados de videiras pelo ELISA indireto, bem como discriminar videiras sadias e infectadas. Muitos vírus que infectam a videira ocorrem em concentrações abaixo do limite de detecção dos testes diagnósticos comumente utilizados. Com isso, um outro objetivo deste trabalho foi detectar importantes vírus dos gêneros Closterovirus (GLRaV-2) eAmpelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1- GLRaV-1 e Grapevine leafroll-associated virus 3 - GLRaV-3), família Closteroviridae, bem como os vírus dos gêneros Foveavirus (RSPaV) e Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) e GVB), família Flexiviridae, através de RT-PCR em tempo real (TaqMan). Para ampelovírus, com primers degenerados e sondas específicas, foram detectados GLRaV-1 e GLRaV-3 nos isolados e /ou cultivares testados. Para closterovírus, com primers degenerados e sonda específica, detectou-se GLRaV-2 em todas as cultivares testadas e em Nicotiana benthamiana. Os membros da família Flexiviridae GVA, GVB e RSPaV foram detectados através de multiplex RT-PCR (TaqMan), demonstrando-se assim, que a RT-PCR TaqMan é um método de diagnóstico molecular rápido, quantitativo, confiável, sensível e capaz de detectar mais de um vírus na mesma reação.The vegetative propagation of the grapevine (Vitis spp.) facilitates the dissemination of pathogens, such as viruses, favoring the appearance of complex diseases, by accumulation of different virus species in the same plant. Among the diseases that affect the grapevine, those caused by viruses are the most difficult to control because the dissemination and the accumulation of viruses are favored by the transport and use of infected propagative material. Due to advanced studies with molecular biology, evidences suggest that some grapevine viruses, as Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) and Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequently present polymorphic sequences, as well as mixing infections with other viruses, making difficult to define the biological properties of the different virus variants. Therefore, one objective of this work was to evaluate the variability of these three important viruses of grapevine using the molecular characterization of the coat protein (CP) gene. Fragments comprising the complete CP genes of RSPaV, GLRaV-2 and of GFLV isolates were amplifiedby RT-PCR, using primers for specific regions of each viral species, allowing the separation of the isolate groups by phylogenetic analyses of the sequences. The isolates of each viral species here studied were additionally detected by non-radioactive probes with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independently of the isolate used as template for probe synthesis. The methods of diagnosis of the grapevine virus diseases can be divided in three categories. The two traditional ones include the biological tests and the serologic diagnosis. Recently, the molecular methods of diagnosis have been developed, comprising the tests RT-PCR, IC-RT-PCR and real time RT-PCR. This last one is the most advanced technique of diagnose and quantification of nucleic acids, accomplishing amplifications in precisely way and with higher reproducibility, allowing the detention of more than one virus in a single reaction. Considering the difficulties to detect virus in grapevine, and the high cost of the diagnosis methods it was considered the production ofantisera against isolates of GLRaV-2 and Grapevine virus B (GVB), developed from CPs expressed in Escherichia coli and to test the possibility of using themfor detecting these two viruses in infected grapevines. The CP genes were amplified by RT-PCR, cloned, sequenced and later subcloned, where the recombinant plasmids were employed in the transformation of E. coli and in the expression of CPs. The proteins were purified, their identities confirmed by SDS-PAGE and Western blot and used for immunizing rabbit. The antisera produced against these proteins were capable to recognize corresponding recombinant proteins in Western blot and to detect GLRaV-2 and GVB in infected grapevines by indirect ELISA, as well as discriminating healthy and infected grapevines. Many viruses that infect grapevine occur in concentrations under the limit of detention of the diagnostic tests commonly used. Considering this fact, another objective of the present work was to detect important viruses of the genera Closterovirus (GLRaV-2) and Ampelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1 and Grapevine leafroll-associated virus 3- GLRaV-3), family Closteroviridae, as well as the viruses of the genera Foveavirus (RSPaV) and Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) and the GVB),family Flexiviridae, by real time RT-PCR (TaqMan). For ampelovirus, with degenerate primers and specific probes GLRaV-1 and GLRaV-3 were detected in isolates and/or cultivars tested. For closterovirus with degenerate primers and specific probes GLRaV-2 was detected in all cultivars tested and in Nicotiana benthamiana. The members of the family Flexiviridae GVA, GVB and RSPaV were detected by multiplex RT-PCR (TaqMan), demonstrating that RT-PCR TaqMan is a fast method for molecular diagnosis, quantitative, reliable, sensitive and applicable for detecting more than one virus in the same reaction
Jan Kreuze - One of the best experts on this subject based on the ideXlab platform.
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Family Flexiviridae: a case study in virion and genome plasticity.
Annual Review of Phytopathology, 2007Co-Authors: G. P. Martelli, M J Adams, Jan KreuzeAbstract:AbstractThe plant virus family Flexiviridae includes the definitive genera Potexvirus, Mandarivirus, Allexivirus, Carlavirus, Foveavirus, Capillovirus, Vitivirus, Trichovirus, the putative genus Citrivirus, and some unassigned species. Its establishment was based on similarities in virion morphology, common features in genome type and organization, and strong phylogenetic relationships between replicational and structural proteins. In this review, we provide a brief account of the main biological and molecular properties of the members of the family, with special emphasis on the relationships within and among the genera. In phylogenetic analyses the potexvirus-like replicases were more closely related to tymoviruses than to carlaviruses. We postulate a common evolutionary ancestor for the family Tymoviridae and the two distinct evolutionary clusters of the Flexiviridae, i.e., a plant virus with a polyadenylated genome, filamentous virions, and a triple gene block of movement proteins. Subsequent recombina...
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Family Flexiviridae: a case study in virion and genome plasticity.
Annual review of phytopathology, 2007Co-Authors: G. P. Martelli, Michael J. Adams, Jan KreuzeAbstract:The plant virus family Flexiviridae includes the definitive genera Potexvirus, Mandarivirus, Allexivirus, Carlavirus, Foveavirus, Capillovirus, Vitivirus, Trichovirus, the putative genus Citrivirus, and some unassigned species. Its establishment was based on similarities in virion morphology, common features in genome type and organization, and strong phylogenetic relationships between replicational and structural proteins. In this review, we provide a brief account of the main biological and molecular properties of the members of the family, with special emphasis on the relationships within and among the genera. In phylogenetic analyses the potexvirus-like replicases were more closely related to tymoviruses than to carlaviruses. We postulate a common evolutionary ancestor for the family Tymoviridae and the two distinct evolutionary clusters of the Flexiviridae, i.e., a plant virus with a polyadenylated genome, filamentous virions, and a triple gene block of movement proteins. Subsequent recombination and gene loss would then have generated a very diverse group of plant and fungal viruses.
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Family Flexiviridae: A Case Study in Virion and
2007Co-Authors: G. P. Martelli, Michael J. Adams, Jan KreuzeAbstract:The plant virus family Flexiviridae includes the definitive genera Potexvirus, Mandarivirus, Allexivirus, Carlavirus, Foveavirus, Capillovirus, Vitivirus, Trichovirus, the putative genus Citrivirus, and some unassigned species. Its establishment was based on similarities in virion morphology, common features in genome type and organization, and strong phylogenetic relationships between replicational and structural proteins. In this review, we provide a brief account of the main biological and molecular properties of the members of the family, with special emphasis on the relationships within and among the genera. In phylogenetic analyses the potexvirus-like replicases were more closely related to tymoviruses than to carlaviruses. We postulate a common evolutionary ancestor for the family Tymoviridae and the two distinct evolutionary clusters of the Flexiviridae, i.e., a plant virus with a polyadenylated genome, filamentous virions, and a triple gene block of movement proteins. Subsequent recombination and gene loss would then have generated a very diverse group of plant and fungal viruses.
